CALCOLOSI RENALE (lettura)

STUDIO METABOLICO DEL RISCHIO NEFROLITIASICO

dr Gianni Cangiano

Biologo UOC Laboratorio di Patologia Clinica - P.O. dei Pellegrini ASL NA 1 CENTRO

Tel. 081 2543438 ; e-mail: Questo indirizzo e-mail è protetto dallo spam bot. Abilita Javascript per vederlo.

Argomenti

00. Introduzione

01. Formazione del calcolo

02. Fattori di rischio

03. Composizione dei calcoli

04. Associazione epidemiologica

05. Esami di Laboratorio da richiedere

06. Parametri da considerare nello studio metabolico del rischio nefrolitiasico

07. Modalità di raccolta dei campioni urinari

08. Citrati - dosaggio

09. Ossalati - dosaggio

10. Solfati - dosaggio

11. Cistina - dosaggio

12. Refertazione cistinuria e studio metabolico

13. Metodi analitici per la determinazione dei calcoli urinari

14. Determinazione chimica dei calcoli urinari

15. Nostro dosaggio fotometrico dei calcoli urinari

16. Calcoli urinari all'infrarosso

17. Letteratura

 

00. Introduzione

Lo studio metabolico della calcolosi renale consente la correzione e la prevenzione dei fattori di rischio degli eventi litiasici ma anche quelli di danno renale e cardiovascolare. Sotto indicazione del Medico di Medicina Generale o del Nefrologo il nostro Laboratorio di Patologia Clinica (P.O. dei Pellegrini ASL NA 1 Centro - Direttore: dr Antonio Sarappa) effettua degli esami sulle urine della mattina (calcio e creatinina) e su quelle delle 24 ore (calcio, fosforo, magnesio, acido urico, ammonio, sodio, potassio, cloro, proteine urinarie, urea, creatinina, solfati, ossalati, citrati e cistina). Un referto finale indicherà la tendenza (supersaturazione relativa) a formare dei calcoli urinari di calcio ossalato, calcio fosfato mono acido, acido urico e cistina. Dal 2003 il nostro Laboratorio gestisce la calcolosi renale con un software in Access da noi costruito e con delle metodiche del commercio “manuali” da noi adattate su strumentazione biochimica (ossalati e citrati). Il pannello routinario delle determinazioni urinarie viene completato dai dosaggi di solfati e cistina, non esistenti in commercio, ma da noi costruiti ed adattati su semplici analizzatori di chimica clinica. Particolarmente rilevante appare il dosaggio fotometrico della cistina, abbastanza rapido (circa 15-20 minuti) e con un costo di pochissimi euro che ha escluso definitivamente il test di Brand (poco specifico e non più utilizzabile per la presenza di cianuro), ma anche l’analisi cromatografica (indaginosa, costosa e praticata in pochissimi Centri specializzati), effettuata solamente in casi di conferma. I primi 6 argomenti di questa trattazione si riferiscono alla formazione del calcolo, ai fattori di rischio, ai parametri che influiscono sullo studio metabolico, ecc. I successivi argomenti evidenziano le procedure e le metodiche di laboratorio da noi utilizzate. Di particolare importanza è il software in Excel da noi creato per la determinazione delle componenti di un calcolo urinario.

 

01. Formazione del calcolo

La calcolosi renale è una condizione clinica comune che colpisce il 2-3% della popolazione ed il 75% di queste persone subisce una ricaduta almeno un altra volta nel resto della propria vita (stone former). La patogenesi della calcolosi renale va ricercata in alterazioni metaboliche e fisiologiche che modificano la capacità del rene a mantenere in soluzione nelle urine sostanze che, aggregandosi, possono formare nuclei litogeni. La formazione di qualsiasi tipo di cristallo è possibile solamente in una soluzione supersatura in cui detriti cellulari o altri cristalli (urati, brushite, ossalato di calcio) vanno incontro a nucleazione. La supersaturazione favorisce, infatti, la aggregazione di cristalli in cristalli sempre più grandi, che danneggiano le cellule tubulari, rimanendovi adesi. Questo processo può indurre la progressiva formazione del calcolo che è favorita anche da una bassa concentrazione di inibitori della cristallizzazione. Pertanto, la nefrolitiasi dipende dalla rottura dell’equilibrio tra fattori che promuovono e fattori che inibiscono l’aggregazione dei cristalli. I principali ioni che, cristallizzando, contribuiscono alla formazione dei calcoli sono calcio, ossalato, urato e fosfato. Gli inibitori della cristallizzazione includono macromolecole a basso peso molecolare (magnesio, citrato e pirofosfato) e ad alto peso molecolare (glicosamminoglicani, proteine). I mucopolissaccaridi, grazie alle loro proprietà colloidali, favoriscono il mantenimento in soluzione dei sali allontanando la formazione di calcoli renali.

 

02. Fattori di rischio

Importante è l'area geografica: a. nei paesi a basso tenore di vita (Medio ed Estremo Oriente, Africa): si ha calcolosi con prevalente localizzazione vescicale; b. nei paesi a medio tenore di vita ed in via di sviluppo: prevalente è la localizzazione renale rispetto alla vescicale; c. nei paesi ad alto tenore di vita ed industrializzati: la malattia è largamente diffusa con prevalenza renale;

Negli ultimi 20 anni si è avuto un aumento della malattia dal 17 al 30% . Il 13% della popolazione tra 20 e 70 anni corre il rischio di formare un calcolo, almeno una volta nella vita e la frequenza è doppia nel maschio rispetto alla femmina. Nei maschi, la possibilità di formare calcoli avviene in una età inferiore ai 65 anni. Studi dimostrano che in un paziente che ha avuto un primo calcolo, la probabilità di formare un secondo calcolo è di circa il 15% in un anno, 35-40% in 5 anni, 60% in dieci anni e 80% nell’arco della vita.  Importante è la storia familiare ma anche alcune condizioni cliniche quali ad es. la diarrea cronica, l'iperparatiroidismo, la gotta, ecc. . E' importante anche la ridotta diuresi per fattori ambientali: occupazione, attività sportiva, esposizione al sole; Tutti i rilevamenti concordano nell'indicare una maggiore incidenza di calcolosi durante i mesi estivi. L'aumento di temperatura che si registra nei mesi estivi infatti, provocando un incremento della traspirazione e della sudorazione, determina una iperconcentrazione urinaria. Le diete ricche di purine (frattaglie) e grassi animali, l’eccessivo introito di sale sono fattori predisponenti la formazione di calcoli specie in soggetti in soprappeso; inoltre il consumo frequente di bevande analcoliche acidificate con acido fosforico (coca cola) per più di un litro a settimana, il the, e il succo di pompelmo, possono contribuire ad aumentare il rischio di calcoli; ancora sostanze ricche di ossalato come spinaci, cacao, noci, noccioline, cioccolato, sono favorenti la precipitazione di cristalli nella calcolosi calcica.

 

03. Composizione dei calcoli

In base alla composizione chimica si distinguono diversi tipi di calcoli ognuno dei quali richiede un approccio terapeutico differente.

a. Sostanze organiche: Acido urico, cistina, urato acido di ammonio. Vanno aggiunti i calcoli di origine rara (incidenza 1-2%) che possono essere causati dall’accumulo di xantina, ipoxantina, colesterolo, acidi grassi o 2-8-idrossiadenina.

b. Sostanze inorganiche: Ca-ossalato mono-idrato: whewellite; Ca-ossalato di-idrato: wedellite; Fosfato ammonio magnesiaco esa-idrato: struvite; Fosfato bibasico di Ca di-idrato: brushite; Fosfato tricalcico: whitelockite; Carbonato apatite; Idrossiapatite. La classificazione della calcolosi è così illustrata:

Nella figura vengono illustrati alcuni dei più importanti calcoli riscontrabili:


04. Associazione epidemiologica

La calcolosi renale mostra un’associazione epidemiologica con il soprappeso, l’obesità, l’ipertensione arteriosa, il diabete e la sindrome metabolica, tutte condizioni che hanno uno stretto rapporto con l’alimentazione. Ecco quindi che la terapia medica della calcolosi renale, e in particolare quella dietetica dovrà essere indirizzata alla correzione e prevenzione non solo dei fattori di rischio di recidive litiasiche ma anche ai fattori di rischio di danno renale e cardiovascolare. Ecco perché in un inquadramento clinico e un approccio nutrizionale nei pazienti con calcolosi renale dovrebbe estendersi anche agli aspetti renali, ossei e cardiovascolari. Del resto, molti dei provvedimenti primariamente indicati per la prevenzione della calcolosi, quali la riduzione del sale e degli zuccheri semplici, la limitazione dei formaggi e delle proteine animali, la spinta ad una dieta ricca in alimenti vegetali, sono elementi che caratterizzano la dieta mediterranea e che tra i vari effetti benefici trovano applicazione anche nella prevenzione del rischio cardiovascolare. In questo senso, l’ambulatorio dedicato alla calcolosi renale può rappresentare una opportunità, per il paziente e per il nefrologo, per impostare una precoce prevenzione e trattamento anche della sindrome metabolica e dei fattori di rischio cardiovascolare.


05. Esami di Laboratorio da richiedere

Il Medico di Base, con un’anamnesi ben condotta ed un n° limitato di esami, riesce ad: individuare alcune forme di calcolosi secondaria; selezionare pazienti a maggior rischio di malattia renale cronica; selezionare pazienti a maggior rischio di malattia metabolica ossea.

(CIT = citrati ; CIST = cistina ; SOLF = solfati ; OSS = ossalati ; ALP = fosfatasi alcalina ; EAB = equilibrio acido base ; PTH = paratormone ; NH4 = ammonio )


06. Parametri da considerare nello studio metabolico del rischio nefrolitiasico

Terapia idrica (volume urinario). La diluizione delle urine, abbassando la concentrazione urinaria dei sali litogeni, ha un ruolo fondamentale nel ridurre l’incidenza di episodi litiasici. Da definire non è tanto la quantità di acqua da bere ma il volume di diuresi da ottenere nelle 24 ore. Per diminuire la litogenesi bisogna mantenere la diuresi a circa 2 litri/die. Da studi effettuati si evidenzia che i ¾ dei pazienti mantengono un apporto idrico inadeguato per prevenire le recidive. Un’indicazione potrebbe essere quella di bere sino ad assicurare una diuresi di almeno 2 litri; un’indicazione meno oggettiva che non obbliga a misurazioni volumetriche può essere quella di assicurare una urina chiara e non gialla. Tutte le acque sono consigliabili purché con basso contenuto di sodio. Sono sconsigliati invece il succo di pompelmo e di mela per l’alto contenuto di vitamina C precursore dell’ossalato. L’assunzione dovrebbe essere distribuita nel corso di tutta la giornata per assicurare un volume urinario costantemente elevato. Il consiglio è di introdurre 250-300 ml di liquidi ogni ora sia durante la giornata che, in caso di risveglio, nelle ore notturne; un maggiore apporto è indicato nei periodi estivi e in presenza di attività fisica. Almeno metà dei liquidi introdotti dovrebbero essere rappresentati dall’acqua per evitare la presenza di sostanze controindicate.

 

Calcio. L’escrezione urinaria rende normalmente conto del bilancio tra quota di calcio assorbita a livello intestinale e quota di calcio depositata o rilasciata dal rimaneggiamento continuo del tessuto osseo. La regolazione si ha tramite PTH, attraverso stimolazione del riassorbimento di calcio nel tubulo distale. L’ipercalciuria è sostenuta da eccessivo assorbimento intestinale, da eccessivo riassorbimento osseo, o da diminuzione del riassorbimento tubulare renale. Una volta escreto nelle urine, il calcio non è molto solubile come sale sia di ossalato che di fosfato e, quindi in eccesso, precipita e determina la formazione di calcoli. E’ stato ampiamente dimostrato che la dieta ipocalcica indiscriminata aumenta il numero delle recidive, se confrontata ad una dieta normocalcica (aumenta infatti l’ossaluria con il diminuire dell’escrezione del calcio). Il calcio alimentare nell’intestino chela l’ossalato, riducendone l’assorbimento! Alla luce di questi dati, l’indicazione più corretta da dare ai pazienti, soprattutto in assenza di screening metabolico, è di seguire una dieta normocalcica. Il calcio poi, normalmente si lega al citrato che ne impedisce quindi la precipitazione nelle urine; inoltre una sua carenza a lungo andare crea un bilancio negativo che nelle donne può favorire l’osteoporosi. Il calcio è ridotto tranne che per i rari casi di ipocitraturia.

Citrato. Presente in frutta e verdura. E’ un prodotto intermedio del metabolismo ossidativo, liberamente filtrato dal glomerulo, riassorbito in misura variabile nel tubulo prossimale, e non secreto a livello tubulare. L’acidosi aumenta il consumo mitocondriale di citrati e, in conseguenza di ciò, ne riduce la concentrazione citoplasmatica. A livello renale, la riduzione della concentrazione citoplasmatica di citrati ne accelera il riassorbimento dal lume verso l’interno della cellula. Il citrato è un anione presente nelle urine in forma trivalente, particolarmente importante nel ridurre la sovra saturazione dei sali litogeni, attraverso 3 azioni: chelante nei confronti del calcio a livello urinario; di antiaggregazione sui cristalli; di alcalinizzazione urinaria. Ne deriva che la riduzione della citraturia è tra le principali cause della litogenicità.

Sodio. La presenza generosa di sodio nella dieta incrementa l’escrezione tubulare del calcio (in particolare negli ipercalciurici), aumentando di fatto il rischio litogeno. Per ridurre l’escrezione urinaria di calcio è molto più utile ridurre l’apporto alimentare di sodio. Si consiglia perciò di non superare quella che del resto è l’assunzione consigliata dalle linee guida, cioè i 6 grammi (o 100 mmol/die di sodio) al dì. Per ridurre l’apporto di sale: non aggiungere mai sale ai piatti una volta a tavola; ridurre al minimo il consumo di sale nella preparazione e nella cottura dei cibi; evitare cibi trattati con sale, conservati in scatola, in salamoia, essiccati o affumicati; evitare gli alimenti naturalmente ricchi in sodio quali rognone, fegato, molluschi; preferire il pane toscano senza sale; preferire formaggi meno ricchi di sale (ricotta, mozzarella, Grana Padano); evitare l’uso di margarina e burro come grassi di condimento.

Solfati. Le proteine introdotte con alimenti animali hanno un effetto pro-litogeno, in quanto sono acidificanti e quindi aumentano l’escrezione renale di calcio e riducono quella di citrato; l’escrezione di acido urico aumenta così come quella di ossalato grazie al carico di precursori (purine ed aminoacidi, rispettivamente). La presenza di solfati (quale indice indiretto di apporto di proteine animali) si correla con la diminuzione proporzionale del pH, fattore che incrementa la possibilità di precipitazione litiasica. L’apporto proteico non dovrebbe superare la quantità di 1 grammo per Kg di peso corporeo, in massima parte da fonti di origine vegetale.

Alimentazione vegetariana. Una alimentazione principalmente vegetariana, benché teoricamente abbia un contenuto elevato di ossalato, può essere utile perché l’assorbimento intestinale di ossalato è relativamente basso, in quanto c’è un elevato contenuto di acqua, fibre, potassio, magnesio, carbonato e citrato, un limitato contenuto di proteine e sodio, ed un ridotto contenuto di acidi grassi saturi e colesterolo. Ne deriva una riduzione della calciuria e aumento del citrato e pH. Ecco quindi che l’utilizzo di proteine vegetali è da preferire per la calcolosi ossalocalcica e in particolare per quella di acido urico.


L’ossalato urinario di origine alimentare rappresenta solo il 10-20% dell’ossalato escreto, essendo la restante parte di origine endogena (metabolismo dell’acido ascorbico e di alcuni aminoacidi). Infatti fino a 70-100 mg/die di ossalato vengono metabolizzati e degradati da batteri normalmente presenti nel lume intestinale, come l’Oxalobacter formigens. L’unica modalità di eliminazione è rappresentata dal rene, che utilizza un meccanismo di secrezione tubulare presente nel tubulo contorto prossimale. Le indicazioni dietetiche prevedono quindi una riduzione moderata dell’assunzione di ossalato, escludendo soltanto gli alimenti che ne sono molto ricchi (frutta secca, spinaci, cioccolato, ecc.) mentre la sua restrizione deve essere più attenta in caso di dieta ipocalcica o di patologie infiammatorie intestinali, o in presenza di steatorrea, perché in questi casi si verifica un aumento dell’assorbimento intestinale di ossalato; la Vitamina C è un noto precursore dell’acido ossalico, e quindi è da sconsigliarne l’assunzione a dosaggi elevati. Cibi ricchi di ossalati (da limitare od escludere dalla dieta): spinaci, rabarbaro, prezzemolo, erba cipollina, bietola, barbabietola rossa, verza, pomodori verdi, the verde, cacao in polvere, cioccolato. Consiglio: lessare le verdure in abbondante acqua acidulata per favorire la fuoriuscita degli ossalati. Cibi con consumo minimo o nullo in ossalati da inserire nella dieta abituale: latte, yogurt senza frutta, formaggio, manzo, pesce, pollame, uova, banane, ciliegie, mele, meloni, cipolle, patate, piselli, ravanelli, pane, pasta, condimenti.

 

Acido urico. L’iperuricuria è importante nella calcolosi da acido urico, molecola che deriva dal metabolismo delle purine e poco solubile a pH fortemente acido. Alimenti da limitare od evitare nella dieta abituale: frutti di mare, acciughe, sardine sott’olio, aringa, caviale, frattaglie, estratti di carne, brodo di carne, cacciagione, intingoli, carni e pesci grassi. Fra i prodotti da usare con moderazione: carne o pesce una sola porzione al giorno.

Carboidrati. Un carico di glucosio induce un aumento della calciuria nei soggetti normali ed ancora di più nei soggetti ipercalciurici: questo effetto è con molta probabilità mediato da una iperincrezione di insulina. La riduzione dell’apporto di zuccheri semplici (e di calorie nel suo complesso) è quindi un provvedimento sicuramente utile. E’ altresì opportuno moderare il consumo di cibi che hanno effetti acidificanti quali quelli ricchi di proteine animali e quelli ricchi di fruttosio; questo riduce la produzione endogena netta di acidi, e così il grado di acidificazione urinaria, contrastando la soprasaturazione e quindi la cristallizzazione dell’acido urico. Una certa attenzione deve essere posta a non eccedere con la frutta, per l’elevato apporto di zuccheri semplici che ne deriverebbe.Non più di due porzioni di frutta al giorno, evitando quella molto zuccherina o sciroppata. Ridurre fortemente le bevande alcoliche, dolci e dolcificanti.


Cistinuria. La cistinuria è una malattia ereditaria caratterizzata dalla formazione di calcoli a carico delle vie urinarie che hanno la tendenza a recidivare con notevole frequenza e sono molto resistenti alla terapia medica e chirurgica. A livello del tubulo prossimale, non si riassorbire la cistina che può, quindi, precipitare e formare i calcoli. In questa malattia, insieme alla cistina, anche altri tre aminoacidi dibasici (ornitina, arginina e lisina) vengono persi con le urine. La malattia ha una trasmissione ereditaria autosomica recessiva. Questo vuol dire che entrambi i genitori sono portatori sani del gene anormale. Perché la malattia possa svilupparsi è necessario che nel bambino siano presenti ambedue le mutazioni dei genitori. L’unione di due portatori comporta perciò la malattia nel 25% dei figli. Se invece un genitore è sano e l'altro portatore, il 50% dei figli saranno portatori sani; se un genitore è sano e l'altro malato, il 100% dei figli risulteranno invece portatori sani; Naturalmente da due genitori malati nasceranno soltanto figli malati. La cistinuria è causata da una mutazione dei geni SLC3A1 (Solute carrier family 3 - amino acid transporter heavy chain, member 1 – sito sul cromosoma 2) e SLC7A9 (solute carrier family 7 - cationic amino acid transporter, y+ system, member 9 – sito sul cromosoma 19), che codificato per due parti di una proteina di membrana localizzata principalmente a livello renale. In conseguenza della mutazione è presente un difettoso meccanismo di trasporto transepiteliale nel riassorbimento della cistina e degli aminoacidi dibasici (lisina, arginina e ornitina) nel rene e nell'intestino. Il trasportatore di membrana coinvolto nel difetto è costituito da un complesso eterodimerico, formato da due subunità unite da un ponte disolfuro ben conservato, analogamente a quanto riscontrato per altri trasportatori di aminoacidi. Una delle due proteine funge da carrier di membrana (b0,+AT) e media il trasporto di aminoacidi, mentre l’altra ha la funzione di “ancorare” il trasportatore alla membrana plasmatica (r-BAT).

Le mutazioni in eterozigosi, cioè su un solo allele, del gene SLC3A1 solitamente non danno luogo ad alterazioni nell'escrezione di cistina; al contrario, le mutazioni in eterozigosi di SLC7A9 possono associarsi a un'alterazione nel riassorbimento di questo aminoacido con gravità variabile dal normale fino ai livelli degli omozigoti. A seconda degli alleli coinvolti si distinguono 3 tipi di cistinuria, denominati rispettivamente A, B e AB: - Tipo A: dipende da mutazioni in entrambi gli alleli (omozigosi) del gene SLC3A1. - Tipo B: mutazioni in omozigosi del gene SLC7A9. - Tipo AB: mutazioni su un allele del gene SLC3A1 e uno del gene SLC7A9 (doppia eterozigosi). I tre tipi descritti rappresentano rispettivamente il 38%, il 47% e il 14% dei casi di cistinuria. Portatori sani della cistinuria di tipo A hanno sempre una escrezione di aminoacidi normale nelle urine, mentre i portatori di tipo B hanno una escrezione urinaria di cistina e degli aminoacidi dibasici elevata in oltre l’80% dei casi ma solitamente non producono calcoli. La terapia medica prevede il ricorso a diverse misure associate: diluire le urine bevendo abbondante quantità di liquidi (2-4 litri al giorno). Non è necessario il ricorso ad acque oligominerali, non essendo la cistina presente nell’acqua; alcalinizzare le urine per ridurre la probabilità di precipitazione della cistina con citrato di potassio o bicarbonato di sodio. Importante è il ricorso ai chelanti della cistina (terapia farmacologica): devono però essere misurati periodicamente i livelli di cistina libera nelle urine, ponendo attenzione agli effetti collaterali, primo fra tutti la comparsa di proteinuria, che può essere spia di una nefropatia indotta da farmaci; La dieta deve essere moderatamente iposodica, mentre non ha alcun ruolo una dieta a basso contenuto di cistina perché la produzione di cistina è prevalentemente endogena. Anche la riduzione dell’apporto del suo precursore (metionina) è difficile da realizzare e di scarso significato clinico. Nella maggior parte dei casi è fondamentale la terapia famacologica.


07. Modalità di raccolta dei campioni urinari

Lo studio metabolico si effettua in regime ambulatoriale rispettando le seguenti condizioni: condizioni alimentari standardizzate; assenza di episodi di colica e di ostruzione in atto; dopo sospensione di farmaci (es.: allopurinolo, alcalinizzante, tiazidici, ecc.). da almeno 15 giorni. Il Personale del Laboratorio di Patologia Clinica si fa carico di mettere al corrente l’Utenza sulle peculiari modalità di raccolta urinaria delle 24 ore. Il Laboratorio inoltre rilascia agli interessati un apposito kit (vedi figura) contenente istruzioni (vedi allegato A), etichette adesive per i contenitori, modulistica esami per eventuali impegnative del SSN, provette contenente conservanti pericolosi (5 ml di acido cloridrico concentrato e 2 ml di clorexidina digluconato 20%) ed infine il relativo modulo di assunzione di responsabilità da firmare.


La doppia raccolta doppia delle urine delle 24 ore può essere facilmente effettuata in ambito domiciliare. Il paziente effettua la raccolta scartando l’urina al risveglio e raccogliendo tutte le minzioni fino alla prima urina del mattino seguente. L’urina di ogni minzione si divide in due aliquote che vengono riposte in due differenti recipienti da 2,5 litri (si possono usare anche 2 bottiglie di plastica da 2 litri). Il primo contiene 5 ml di acido cloridrico concentrato, necessario ad evitare la formazione dei precipitati di calcio. Nel secondo contenitore sono invece presenti 2 ml di clorexidina (disinfettante), necessaria al dosaggio di alcuni analiti urinari ma principalmente alla determinazione del pH.

 

La clorexidina infatti è un potente battericida che impedisce la degradazione dell’urea e quindi l’alcalinizzazione delle urine.

Ad ogni minzione è fondamentale la miscelazione dei liquidi contenuti nelle bottiglie con le urine. E’ evidente che la diuresi totale delle 24 ore è rappresentata dalla somma dei volumi raccolti nei due contenitori (se la divisione delle aliquote è stata ben fatta, sarà sufficiente moltiplicare per 2 il volume di urina contenuto in una delle due bottiglie). Viene inoltre richiesto un prelievo urinario della mattina (urine fasting: minzione successiva a quella delle 24 ore e raccolta “a digiuno”). In figura sono rappresentati i diversi analiti urinari dosati sulle urine della mattina e su quelle delle 24 ore (acido cloridrico: HCl; clorexidina: CLX).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La determinazioni della calciuria (in mg/dl) e della creatininuria (in mg/dl) nelle urine estemporanee, espresse come rapporto Ca/Crea, mettono in evidenza il significato della eventuale ipercalciuria (>200 mg) riscontrata nella raccolta delle 24h: se il valore è inferiore a 0,11 , l'ipercalciuria è di origine alimentare; superiore a tale soglia, il significato è metabolico.

 

Lo studio metabolico del rischio nefrolitiasico si effettua nel nostro Laboratorio in un tempo di circa 7-10 giorni: inizialmente, all’atto della consegna dei campioni urinari, si dosano tutti gli analiti presenti nel pannello routinario dei più comuni analizzatori biochimici (nel nostro caso Cobas 6000 Roche); si misura anche il volume delle 24h ed il pH ed inoltre si effettua la purificazione delle urine per il dosaggio degli ossalati. Dopo circa una settimana si determinano ossalati, citrati, cistina e solfati urinari su altra strumentazione di laboratorio (nel nostro caso Viva E Siemens) più facilmente accessibile dall’operatore per quanto riguarda la programmazione di metodiche commercializzate per dosaggi “manuali” (ossalati e citrati) e create da noi (solfati e cistina). Segue poi il calcolo delle supersaturazioni urinarie (SSR) per calcio ossalato, calcio fosfato, acido urico e cistina. Uno specifico programma in Access, da noi costruito, consente la gestione della calcolosi renale.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

08. Citrati - dosaggio

La determinazione dei citrati urinari si esegue con il kit della ditta LTA e si basa sulla reazione fotometrica in basso raffigurata e si legge a 340 nm per formazione di NADH. Il primo reattivo è costituito dal liofilo R1 (contiene MDH e NADH) che si ricostituisce con 20 ml di tampone (tampone Good pH 7,8 e LDH) mentre il secondo reattivo è costituito dal liofilo R2 (reagente starter che contiene citrato liasi), che si ricostituisce con 5 ml di tampone. Lo strumento preleva 6 ml di urina e li miscela a 220 ml di primo reattivo. Dopo circa 4,5 minuti lo strumento aggiunge 60 ml di secondo reattivo. Dopo un'attesa di circa 6,5 minuti c'è la lettura a termine a 340 nm (lunghezza d'onda secondaria: 436 nm). Lo strumento effettua un bianco reagenti ed una calibrazione ad un punto.

 

09. Ossalati - dosaggio

Il dosaggio degli ossalati si esegue con il kit della ditta LTA e prevede l’uso di urina purificata a causa dei numerosi interferenti della reazione Trinder proposta. Un volume urinario di 2 ml viene corretto a pH 5 – 7 e poi purificato in provette contenenti carbone attivo. Dopo alcune miscelazioni e centrifugazione finale, il sopranatante ottenuto, limpido e incolore, è usato per il test fotometrico.

Il primo reattivo si prepara miscelando in parti uguali il reagente R1 (tampone succinato pH 3,8 e 3-dimetilammino acido benzoico) con il reagente R2 (tampone succinato pH 3,8)  mentre il secondo reattivo è costituito dal liofilo R3, reagente starter che contiene ossalato ossidasi e perossidasi, ricostituito con 5 ml di acqua. Lo strumento preleva 9 ml di urina e li miscela a 220 ml di primo reattivo. Dopo circa 4,5 minuti lo strumento aggiunge 50 ml di secondo reattivo. Dopo un'attesa di circa 6,5 minuti c'è la lettura a termine a 578 nm. Lo strumento effettua un bianco reagenti ed una calibrazione ad un punto.

 

10. Solfati - dosaggio

La determinazione dei solfati urinari si basa sulla rilevazione turbidimetrica di solfato di bario, letto a 436 nm. Mentre per ossalati e citrati sono necessari solamente un bianco ed uno standard, invece per calibrare i solfati sono necessari 6 calibratori da 0 a 400 mg/dl. Il reagente di cloruro di bario viene preparato "al momento" e necessita di una pesata di circa 0,1 g di cloruro di bario sciolto in 12,5 ml di tampone acetato 0,2 M (11,5 ml acido acetico glaciale 0,2 M + 0,1 ml di acetato di sodio 0,2 M). Lo strumento preleva 5 ml di urina e li miscela a 220 ml di tampone. Dopo un'attesa di circa 4,5 minuti c'è la lettura a termine a 436 nm.

 

11. Cistina - dosaggio

La determinazione della cistinuria si effettua con la metodica all’acido fosfotungstico da noi costruita ed adattata su strumentazione biochimica. La quantificazione dell’analita urinario necessita di un tempo di circa 10 minuti e sostituisce la valutazione qualitativa effettuata in passato col vecchio test di Brand, ora non più in uso nei Laboratori per la presenza di cianuro.

 

La metodica da noi costruita necessita di una calibrazione a 6 punti ed il principio si basa sulla colorazione di tutti i gruppi sulfidrici (-SH) presenti nel campione urinario grazie alla colorazione con acido fosfotungstico (terzo reagente). Nel caso della cistina, un opportuno riducente (secondo reagente: solfito di sodio) in ambiente acido (primo reagente: tampone acetato) romperà i legami disolfuro per dare luogo alla formazione di cisteine facilmente colorabili. Questa reazione però non è specifica solo per cistina ma anche per acido urico, acido ascorbico ed altri disolfuri (campione totale) . Un “bianco campione”, eseguito con i reagenti sopra citati ed il cloruro mercurico aggiunto al primo reagente, è in grado di misurare il colore sottratto del contributo della cistina (il cloruro mercurico blocca esclusivamente i gruppi –SH delle cisteine liberate). La concentrazione di cistina si ottiene sottraendo il valore del “bianco campione” a quello del campione totale.

 

 

 

 

Le eventuali positività sono da confermare in cromatografia: un paziente affetto da cistina, oltre ad avere la presenza dello stesso aminoacido, evidenzia nelle urine anche gli aminoacidi dibasici ARG, LYS, ORN, e HYS.

 

Lo strumento Viva E ci permette di dosare la cistinuria a tre reagenti così come illustrato nello schema:

 

Sono necessari 6 standard (da 0 a 40 mg/dl) per effettuare la calibrazione. valori ottenuti superiori a 40 mg/dl sono ridosati automaticamente con un ridotto volume urinario. La sensibilità del metodo è di circa 1,3 mg/dl.

 

 

12. Refertazione di cistinuria e studio metabolico

Il valore di cistinuria viene espresso in mg/24h ma può essere anche rapportato alla creatinina (mmol/mmol): tale correzione consente di riscontrare positività anche in campioni diluiti e quindi apparentemente negativi. Negli esempi di refertazione si mettono in evidenza due campioni di cistina a diverso contenuto, uno palesemente positivo e l’altro di poco superiore al valore di riferimento: ambedue le urine manifestano però netta positività per cistina se si considera il rapporto, molto superiore a 0,05.

 

Nella refertazione dello studio metabolico i parametri urinari vengono riferiti a dei valori soglia nelle 24h e non a dei range come in genere ci si riferisce.Bisogna inoltre dire che, ad es., valori di acido urico inferiori alla soglia possono risultare patologici se c’è un urina con pH acido (si riduce fortemente la solubilità).

Grazie al software in Access da noi creato è possibile refertare tutti gli analiti urinari delle 24 ore, della mattina e le relative supersaturazioni di calcio ossalato (SSR CaOx), calcio fosfato monoacido (SSR CaHPO4), acido urico (SSR UA) e cistina (SSR Cys). I valori superiori a quello soglia (o inferiori nel caso di potassio, citrato, ecc.) sono evidenziati in grassetto. Viene inoltre riportata una nota nel caso di cistina da confermare. In questo referto si evidenzia una ipercalciuria, con un volume urinario molto basso e gli la riduzione del citrato (inibitore della calcolosi calcica). C’è quindi una forte tendenza (elevata SSR) a formare calcoli di calcio ossalato e, a causa del basso pH, anche quelli di acido urico. Nei successivi grafici sono rappresentate le influenze di pH e volume sulle SSR sopra elencate.

 

 

13. Metodi analitici per la determinazione dei calcoli urinari

 

14. Determinazione chimica dei calcoli urinari

Il kit proposto nel commercio contiene sostanze, soluzioni, spatoline e bicchierini in grado di poter quantificare le componenti presenti nel calcolo urinario.

Si illustrano le varie tappe di preparazione del calcolo e di determinazione delle diverse costituenti del calcolo urinario. Una frazione del calcolo evidenziato in figura (calcolo a stampo) si pesta e si tratta con alcune gocce di acido solforico concentrato: la presenza di effervescenza indica la formazione di anidride carbonica e quindi la presenza di carbonato (apatite). Generalmente 50 mg si solubilizzano con 5 gocce di acido solforico; il tutto si porta a 50 ml con acqua distillata.

 


 

Determinazione del calcio

Si effettua per titolazione. 5 ml di soluzione madre si trattano con 2 gocce di NaOH 27% ed una spatola di acido calconcarbonico (indicatore): la presenza di calcio fa evidenziare un colore rosso alla soluzione. La successiva introduzione di EDTA, goccia a goccia e contemporaneamente mescolando, fa virare il colore dal rosso al blu. Si contano le gocce di EDTA utilizzate: ogni goccia rappresenta un contenuto di calcio equivalente al 5% . Nel nostro caso è occorsa solamente 1 goccia e pertanto il contenuto di calcio nel calcolo è equivalente al 5% .

 

Determinazione dell'ossalato

5 ml di soluzione madre si trattano con 2 gocce di tampone borato, 3 gocce di cloruro ferrico e 3 gocce di acido solfosalicilico: si forma un complesso ferro-solfosalicilico colorato in rosso. In un tempo di circa 2 minuti si nota la decolorazione del complesso ad opera dell'ossalato. Il contenuto percentuale di ossalato contenuto nella soluzione si estrapola tramite scala di colori. Nel nostro esempio, la intensa colorazione rossa non indica presenza di ossalato.

 

Determinazione della cistina

5 ml di soluzione madre si trattano con 10 gocce di ammoniaca 10% ed un cucchiaio di solfito di sodio (riducente): in questo modo vengono rotti i ponti disolfuro della cistina e si formano i gruppi sulfidrici. La successiva introduzione di un cucchiaio di nitroprussiato, evidenzia la formazione di un complesso colorato in rosso indicante presenza di cistina. Nel nostro esempio, non si evidenzia contenuto di cistina.

 

Determinazione del fosfato

5 ml di soluzione madre si trattano con 3 gocce di acido fosfomolibdico: si attendono 2 minuti. La presenza di acido urico in presenza di 2 gocce di tampone borato, riduce l'acido fosfomolibdico a blu di molibdeno (da un colore verde si passa ad un colore azzurro). La percentualizzazione del contenuto di fosfato si estrapola da una scala di colori e, nel nostro esempio si valuta un contenuto del 20% .

 

Determinazione dell'ammonio

5 ml di soluzione madre si trattano con il reattivo di Nessler (3 gocce di potassio tetraiodomercurato (II) e con 3 gocce di NaOH 27% ) : in presenza di ammonio si forma lo ioduro di ossido amido di mercurio di colore marroncino. La percentualizzazione del contenuto di ammonio si estrapola da una scala di colori. Nel nostro esempio si valuta un contenuto di ammonio equivalente a circa il 4% .

 

 

 

 

 

Determinazione del magnesio

1 ml di soluzione madre si trattano con 4 ml di acqua distillata. Si aggiungono poi 10 gocce di tampone borato e 10 gocce di colorante. Dopo 1' si legge la reazione: in presenza di magnesio si forma un complesso di colore rosso. La percentualizzazione del contenuto di magnesio si estrapola da una scala di colori. Nel nostro esempio si valuta un contenuto di ammonio equivalente a circa il 5% .

 

Composizione del calcolo - Risultato finale

Grazie alla presenza di un regolo contenuto nel kit, le percentuali ottenute dalle sette prove chimiche evidenziano che, il calcolo a stampo è costituito dal 50% di struvite, quest'ultima formata in parti equimolecolari da fosfato, ammonio e magnesio. Infatti si utilizza tutto il magnesio (5%), tutto il fosfato (20%) ed il 3,8% dell'ammonio (in totale era il 4%). Non siamo in grado di utilizzare il 5% del calcio che necessiterebbe dell' 8% di fosfato per formare il 13% di apatite (il carbonato è positivo!).

Il problema di dare una giusta percentuale delle componenti trovate risalta subito agli occhi se valutiamo alcune differenze di colore, specifiche per ogni prova, così come illustrato in figura. E' difficile infatti identificare la giusta percentuale tra 30 e 40% di ossalato e così vale anche per gli altri riquadri colorati più critici.

 

 

15. Nostro dosaggio fotometrico dei calcoli urinari

Come per lo studio metabolico, anche per la determinazione dei 7 parametri biochimici possibili ed ottenibili in un comune calcolo urinario si effettuano i dosaggi biochimici su Cobas 6000 (calcio, fosforo, acido urico, magnesio ed ammonio) e su Viva E (ossalati e cistina).

Le diverse concentrazioni ottenute (calcio, fosforo, magnesio, acido urico e cistina in mg/dl; ossalato in mmol/l ed ammonio in mg/dl) si inseriscono in un nostro programma creato in Excel e precisamente nelle celle E5-E11;

Excel provvede alla conversione di tutte le concentrazioni in mg/dl ed espresse ora nelle celle F5-F11. La somma delle diverse concentrazioni ottenute è     evidenziata in F12 e la relativa percentualizzazione delle 7 componenti chimiche è rappresentata nelle celle I5-I11 . Con i pesi molecolari è inoltre possibile ricavare le relative diverse concentrazioni in mmol/dl e visualizzate nelle celle H5-H11 .

Le micromoli/dl di struvite si estrapolano dal confronto delle micromoli/dl di fosforo, magnesio ed ammonio (celle O4-P4 e Q4): la più piccola concentrazione rilevata (nel nostro caso dell'ammonio: 100,6 mmol/dl) costituisce anche la concentrazione di struvite (cella Q4).

Le micromoli rimanenti di ammonio possono combinarsi con le rispettive micromoli di acido urico (in rapporto equimolecolare) per evidenziare nella cella O8 la concentrazione, sempre in mmol/dl, di urato di ammonio.

Nella cella P8 si confrontano le micromoli/dl di calcio ed ossalato: la concentrazione inferiore rappresenta anche il contenuto di calcio ossalato.

L'eventuale eccesso di acido urico e di calcio possono identificare urato di calcio nella cella O12.

Nelle celle P12 e Q12 sono rispettivamente ricavate le micromoli/dl di calcio e di fosforo in eccesso: in R12 si calcola il relativo rapporto.

A seconda del valore del rapporto calcio/fosforo ottenuto, si ricava il tipo di "calcio fosfato" (brushite: Ca/P = 1,00; fosfato octacalcico: Ca/P = 1,33; whitlockite: Ca/P =  1,50; Idrossiapatite: Ca/P = 1,67; apatite: Ca/P = 2,00) grazie ad una somma di condizioni (K23) messe in relazione con una opportuna matrice (M16:N20). Nel nostro esempio Ca/P, equivalente a 1,91, è indicativo di apatite. Ciò è confermato anche dal fatto che la prova dei carbonati è positiva.

Dal peso molecolare dei vari sali ottenuti, si ricavano i mg/dl (celle U6-U16). Ciò vale anche per i rimanenti contributi delle singole componenti chimiche (residuo inorganico: cella U18). Sarà quindi facile ottenere la percentualizzazione di tutti i sali e del residuo (celle V6-V18).

Il nostro calcolo a stampo ha quindi dato i seguenti risultati: struvite 57,3% - calcio fosfato (carbonato apatite) 41,9% - residuo inorganico 0,8% .

Rispetto al kit commerciale c'è sovrapponibilità solamente con la struvite.

 

16. Calcoli urinari all'infrarosso

La regione dello spettro infrarosso comprende i numeri d’onda nell’intervallo 14000-20 cm-1 e viene usualmente distinta in tre parti: vicino infrarosso (14000-4000 cm-1), medio infrarosso (4000-500 cm-1) e lontano infrarosso (500-20 cm-1). La radiazione di una certa frequenza che interagisce con un campione produce una banda di assorbimento che è caratteristica dell'energia richiesta per la transizione di un particolare gruppo molecolare (generalmente movimenti vibrazionali). Il numero d'onda, è il numero di oscillazioni che un'onda compie nell'unità di spazio ed è quindi l'inverso della lunghezza d'onda

Gli spettrofotometri FT-IR registrano lo spettro in modo simultaneo alle varie lunghezze d’onda dell’intervallo spettrale. Si ha una differenza di cammino ottico (d) tra i raggi riflessi dallo specchio fisso e quello mobile. In questa apparecchiatura non si ha un monocromatore a dispersione, ma viene utilizzato l’interferometro di Michelson, il quale produce nel corso di una speciale scansione l’interferogramma della sostanza in esame. Questo tipo di interferometro basa la separazione delle lunghezze d’onda non sullo spazio ma sul tempo. Dopo il passaggio della radiazione così "trattata" attraverso il campione, l'interferogramma viene trasformato dal calcolatore collegato allo strumento in un tradizionale spettro infrarosso mediante un'operazione matematica, la cosiddetta Trasformata di Fourier. In questa maniera si passa perciò dall’interferogramma, un grafico dello spazio o del tempo, a uno spettro comune, che rappresenta però la variazione dell’intensità del segnale in funzione del numero d’onda (o della lunghezza d’onda) della radiazione. La scansione è possibile grazie a uno specchio mobile che spostandosi introduce una differenza di cammino ottico, che origina una interferenza costruttiva o distruttiva con il raggio riflesso da uno specchio fisso. In questo modo si ottiene un interferogramma che mostra la rappresentazione dell'intensità nel dominio del tempo.

La trasformata di Fourier converte il segnale di  intensità luminosa in funzione del tempo (spostamento dello specchio) in segnale di intensità in funzione del numero d'onda. Per avere un buon interferogramma lo specchio mobile deve avere una velocità costante e la sua posizione deve essere nota in maniera esatta in ogni istante. La spettroscopia FT‐IR offre dei vantaggi: 1) un notevole risparmio di tempo: siccome la radiazione di tutte le lunghezze d'onda viene registrata contemporaneamente dal rilevatore, il tempo di misura si riduce a pochi secondi rispetto ai 10 minuti circa degli strumenti tradizionali; 2) un miglior rapporto segnale‐rumore: rispetto alla tecnica a scansione, dove è registrata sempre una sola lunghezza d'onda (mentre tutto il resto va perso in intensità), la potenza complessiva della sorgente di radiazione rimane costantemente disponibile. Al rivelatore arriva dunque una maggiore potenza rispetto agli strumenti a dispersione.

Le transizioni vibrazionali possono essere di due tipi: stiramento del legame chimico (stretching) e deformazione dell'angolo di legame (bending). Lo stretching può essere simmetrico o asimmetrico. Anche il bending, a sua volta, può essere simmetrico (scissoring, apertura e chiusura di una forbice) o asimmetrico (rocking, oscillazione) nel piano; oppure simmetrico (twisting, torsione) o asimmetrico (wagging, agitamento) fuori dal piano.

La zona dell’impronta digitale non corrisponde a una specifica vibrazione della molecola ma deriva dal fatto che le varie deformazioni, interagendo tra di loro, si combinano dando luogo ad una serie di bande che determinano appunto l’impronta digitale della molecola. Le bande di overtones (>4000 cm-1) risuonano al di fuori del campo specifico dell’IR e sono sempre multipli di altre bande (la banda di 6000 si trova a 3000 – zona osservabile).

la preparazione del campione è così rappresentata:

Si usa il KBr (bromuro di potassio) in quanto tale sale è trasparente all'infrarosso.

Possiamo rappresentare alcuni esempi di sali:

Calcio ossalato: a 1600 c’è il doppio legame C=O . Caratteristici anche i picchi a 1310 (C-C) e a 780 cm-1 (C-O)

Carbonato apatite e triplofosfato (struvite): A 3000 cm-1 c’è la differenza del gruppo NH presente nel triplofosfato. A Circa 1050 cm-1 viene a caratterizzarsi il gruppo PO4

 

Brushite: si nota un picco multiplo per l'assorbimento del fosfato

 

Acido urico e xantina

 

Cistina:

 

Whewellite (CaC2O4.H2O) e wheddellite (CaC2O4.2H2O)

 

 

Esempio n° 1: nel riquadro in rosso si rappresenta una miscela di calcio ossalato e triplofosfato. Per un miglior confronto si rappresenta in alto a destra lo spettro del triplofosfato (caratteristico è l'assorbimento a circa 1000 cm-1) mentre in basso a destra quello del calcio ossalato (caratteristici sono i tre picchi di assorbimento a 1600, 1310 e 780 cm-1).


 

Esempio n° 2: nel riquadro in rosso si rappresenta una miscela di calcio ossalato e brushite. Per un miglior confronto si rappresenta in alto a destra lo spettro della brushite (caratteristico è l'assorbimento multiplo - triplo picco - tra 1200 e 900 cm-1) mentre in basso a destra quello del calcio ossalato (caratteristici sono i tre picchi di assorbimento a 1600, 1310 e 780 cm-1).

 

17. Letteratura

1) Sessa A. Il medico di medicina generale e il paziente con litiasi renale. Giornale di Tecniche Nefrologiche & Dialitiche 2004;3:49-52;

2) Capria A. malattie dei reni: La calcolosi delle vie urinarie. Ed. Idelson-Gnocchi. 2004; 8: 127;

3) Charles YC, Peterson , Poindexeter JR. Adequacy of a single stone risk analysis in the medical evalutation of urolithiasis. The Journal of Urology. 2001; 168: 378-81;

4) Coe FL, Evan A, Worcester E. Kidney stone disease. J Clin Invest 2005; 115: 2598-608;

5) Vitale C, Tricerri A, Manganaro M, et al. Clinical and metabolic features of renal calculi in adults in regard to age of onset. Minerva Urol Nefrol. 1999 Jun; 51(2):

71-4;

6) Di Maina E, Forte F, Risitano A, et al. Diagnosi di laboratorio nello screening metabolico dei pazienti nefrolitiasici: nostra esperienza. Il patologo clinico 2003. n.9-10 e

11-12: 234-8;

7) Sorgia M, Aloia S. la citraturia nell’urolitiasi: aspetti di fisiopatologia. Biologi Italiani. 1992; 10;

8) Qazi YA, Ali Y, Venuto RC. Donor calculi induced acute renal failure. Ren. Fail. 2003 Mar; 25(2): 315-22;

9) Campo S, Pasqua A, Simonetti M, et al. Studio sulla nefrolitiasi nel setting delle cure primarie italiane. SIMG 2011;(2):9-13.

10) Cangiano G., Latte A., e al.. Dosaggio degli ossalati urinari su AU 400 Olympus. Biochimica Clinica. 2010, vol. 34, n.5: 536;

11) Cangiano G., Latte A., e al.. Determinazione di solfati ed ossalati urinari: ulteriori accorgimenti metodologici. Biochimica Clinica. 2012, 36, 6: 498;

12) Zerwekh JE, Drake E, Gregory J, et al: Assay of urinary oxalate: Six methodologies compared. Clin Chem 1983; 29: 1977;

13) Saalfeld U, Freund W. Charakterisierung pulverisierter Sauerteige und Moglichkeiten ihrer qualitativen Bestimmung im Brot – Teil: Sauregehalt und Abbauvermogen

fur L-malat und citrat. Deutsche Lebensmittel-Rundschau. 1999. 95, 209-19;

14) Henninger G, Mascaro L. Enzymatic-ultraviolet determination of citric acid in wine. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1985; 68: 1024-27;

15) Latte A, Cangiano G, Russo M et Al. Determinazione dei citrati urinari su AU 400 Olympus. Biochimica Clinica 2009; 33: 488;

16) Henry K et al. Clinical Chemistry, Principles and Technics. 2 and edition. Harper and Row. New York, London 1974; 590-595;

17) Latte A, Cangiano G, D’Amora M e al.. Screening della cistinuria (metodo al fosfotungstato) su AU600 Olympus e proposta di intervalli di riferimento. Biochimica

Clinica. 2005; 2: 268;

18) Cangiano G, Latte A, Russo M et al. Determinazione fotometrica della cistinuria. Biochimica Clinica. 2007; 4: 267-271;

19) Latte A, Cangiano G, Russo M et al. Determinazione del rapporto cistina/creatinina su AU400 Olympus. Biochimica Clinica. 2007; 5: 523;

20) Cangiano G, Latte A, Russo M et al. Dosaggio elevato al fosfotungstato di valori elevati di cistinuria. Biochimica Clinica 2009; 33: 491;

21) Latte A, Cangiano G, Russo M et al. Dosaggio fotometrico dei solfati urinari. Biochimica Clinica 2006; 4: 398;

22) Latte A, Cangiano G, Russo M et al. Determinazione dei solfati urinari su AU600 Olympus. Biochimica Clinica 2007; 5: 509;

23) Terribile M. Valutazione metabolica e gestione medica della nefrolitiasi: quale futuro? Giorn. Tecn. Nefrol. e didattiche. Ed. Wichtig 2004; 3: 140-2;

24) Marangella M, Petrarulo M, Danielo PG, Sammartano S. Litho risk: software per il calcolo e la visualizzazione dei profili di rischio di calcolosi renale. Giornale Italiano

di Nefrologia 2003; 4: 361-7.

25) Cangiano G, Russo M, Forte F et al. Diagnostica di laboratorio della calcolosi urinaria. Biologi Italiani 2008; 8: 40-7

26) Forte S, Howe T, Ralston J. Access 2000 Tutto & Oltre. SAMS Editore. 2002;

27) Cangiano G., Latte A., e al.. Informatizzazione di laboratorio del rischio nefrolitiasico. Biochimica Clinica. 2012; 6, 36, 602;

28) Cangiano G., Latte A., e al. Studio metabolico della calcolosi urinaria su Viva Vitalab I Congresso Nazionale Medicina di Laboratorio / 43. Congr.so SIBIOC – Parma

15/18 novembre - Comunicazione 92, 2011;

29) Cangiano G., Latte A., e al. Determinazione dei solfati e degli ossalati urinari: ulteriori accorgimenti metodologici. Biochimica Clinica – 2012; 6, 36, 498;

30) Cangiano G., Di Maina E., e al. Ottimizzazione del dosaggio fotometrico della cistinuria. Biochimica Clinica – 2013; 6, 37, 550;

31) Cangiano G., Di Maina E., e al. Estrapolazione in Excel delle componenti del calcolo urinario. Biochimica Clinica – 2013; 6, 37, 551;

32) Cangiano G., Paradisone C., e al. Cistinuria al fosfotungstato: nuovo dosaggio fotometrico a tre reagenti. Biochimica Clinica – 2014; 5, 38, 460;

33) Cangiano G., Di Maina E., e al. Valutazione metabolica della calcolosi urinaria. Biochimica Clinica – 2015; 5, 39, 423;

34) Cangiano G., Di Maina E., e al. Determinazione delle componenti di un calcolo urinario: nuovi accorgimenti metodologici ed informatici. Biochimica Clinica – 2016; 40

SS, S151;

35) Kelly J. Excel 2003. Guida completa. Editore Apogeo. 2002

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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